알츠하이머 병
(Alzheimer's disease)

Ginsenoside Rb1과 CK의 분자구조

Ginsenoside Rb1

흡수율: 1% 미만

CK

흡수율: 100%

Protopanxadiol
(triterpenoid)

독성물질

엠진바이오 경쟁력

발효에 의한 CK 전환율 100%
크로마토그래피에 의하지 않는 CK 대량 정제기술 개발
: 크로마토그라피에 의한 물질 정제(노동집약적) → 순도 99% 이상인 유효
성분 정제(의약품 허가기준) → 생산원가 높아짐 → 상품화 어려움
천연물질에서 유효성분 분자구조 결정 → 합성 → 신약 개발
당이 결합된 물질 (CK) → 합성 불가능
순도 30% 이상인 CK로부터 순도 99%이상인 CK결정체를 생산할 수 있는 기술을 확보함

CK 발효물로부터의 CK 정제

목적: 잔류 농약(농산물이 아닌 제품의 통관 절차에 필요함)제거와 CK의 기능성 방해물질 제거
정제방법: 크로마토그래피를 사용하지 않고 순도 50% 정도는 대량 정제가 가능함
식약처 : 천연물 신약 개발법(임상시험 면제) → 2016년 10월, 삭제
식약처 바이오 생약국 : 의약품 개발 과정(임상시험 포함)을 통해 천연물의 유효성과 안전성(순도와 무관)이 확인이 되면 의약품으로 허가함,
예; 조인스정(SK케미칼); 스티렌정(동아ST)
순도 50% 이상인 CK를 의약품으로 개발 할 예정임

CK-30 제조

홍삼(인삼) 추출물 → CK발효 → 순도 30% 이상인 CK분말
→ CK 15mg 함유된 정제로 제조
품명: CK-30
: 잔류농약(검출항목 244종, 불검출)
: CK를 제외한 어떤 ginsenoside들도 검출되지 않음
: 방해물질 제거로 기능성이 향상 되었음
: 2016년 3월부터 판매시작
: 복용량, 1일 1정
: 홍삼 기능성 식품(CK 기능성 표기 불가)

CK-30 투여에 따른 CK 혈중농도 측정 결과

(천연 진세노사이드가 사람대장내에서 CK로 얼마나 전환되는지도 알아보고자 함)

알츠하이머 병 (Alzheimer's disease, AD)의 보증 증표(hallmark)

신경세포 밖의 β-amyloid 응집판 (β-amyloid plaques in the outside of neuronal cells): AD 환자 95% 이상에서 발견됨
신경세포 내의 고 인산화된 tau에 의한 신경섬유 엉킴 (neurofibrillary tangles made of hyperphosphorylated tau in the inside of neuronal cells)

아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)

: 모든 세포의 세포막 표면에 결합된 단백질(기능성, 미지)
: 신경조직에서는 신경접합에 주로 존재함
: 단백질 분해효소 α-secretase와 γ-secretase에 의한 APP의 절단
→ 수용성 단백질 절편 → APP의 정상적인 제거 방법

AD에서 APP의 분해

α-secretase 발현 감소
β-secretase 발현 증가
β-secretase와 γ-secretase에 의한 APP 분해
    : 아미노산 40개의 β-amyloid peptide Aβ(40)와 아미노산 42개의 β-amyloid peptide Aβ(42)가 형성됨
    : Aβ(40)과 Aβ(42), 불수용성 단백질 → 불수용성 Aβ plaques 형성 → 신경세포 밖에 침착
    : Aβ(42)는 Aβ(40)보다 응집 단백질을 더 잘 형성함
    : Aβ(42)는 더 강한 신경독성 물질임

AD 발생에 대한 유전적 위험요소(genetic risk factor), Ⅰ

APOE: 콜레스테롤을 운반하는 apolipoprotein의 일종
: 뇌 조직에서는 APOE가 주요 apolipoprotein임
APOE: 세 가지 주요 allele 있음
: ε2, ε3, ε4
ε4: AD 발생에서 가장 유력한 유전적 위험요소임
AD 실험동물 모델
: 혈중 콜레스테롤 농도가 높으면 Aβ 침착 증가
: 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추면 Aβ 침착 감소
혈중 콜레스테롤 낮추는 statin복용자를 포함한 참가자 3,099명을 평균 6.1년 추적 조사
: 263명이 AD증상을 보였음
: APOE allele을 분석하였음
: APOE ε4에 의한 AD 발생율은 statin복용과는 상관 관계가 없었음

AD 발생에 대한 유전적 위험요소(genetic risk factor), Ⅱ

Open Access Maced J Med Sci. 2019 Feb 14;7(4):516-520.
Evaluation of APOE Genotype and Vascular Risk Factors As Prognostic and Risk Factors for Alzheimer’s Disease and Their Influence On Age of Symptoms Onset.

AD 환자 144명에서 APOE의 allele을 분석함
대조군: ε4 heterozygote 22.2%; ε4 homozygote, 1.1%
AD 환자: ε4 heterozygote 41.0%; ε4 homozygote, 9.0%
ε4 보유자 중에서의 AD 발병율은 ε3 보유자보다 3배 높았음
발병 연령: ε4 보유자, 67.2±8.3 세
ε4 비보유자, 69.7±9.4세
통계적으로 유의하지 않았음

Prion 전파(propagation)와 유사한 Aβ의 전파

광우병(mad cow disease)의 원인 단백질, prion
자연상태의 conformation을 가진 prion(PrPc), 자연 prion
: 신경세포의 세포막 표면에 결합된 glycoprotein의 일종
: 주로 α-helix의 구성되어 있음
: protease에 잘 분해 됨
변성(denatured)된 conformation을 가진 prion(PrPsc), 변성 prion
: α-helix가 풀려서 β-sheet로 전환된 부분이 많음
: Protease에 의해 분해되지 않음
(가열에 의한 응고 계란 단백질 → 소화 잘 됨)
: 단백질 응집물(protein aggregates)를 형성함 → 염증 유발 → 광우병
: 사람이 변성 prion을 섭취하는 경우 장내 protease에 의해 분해되지 않은 변성 prion → 그대로 흡수됨
변성 prion
: 주위 자연 prion과 접촉하여 이를 변성 prion으로 전환함 → 확산 전파됨 → 병변
Creutzfeldt-Jakob disease(CJD)
: 사람 뇌 조직에서 노화에 의해 자연 prion이 변성 prion으로 전환됨
→ sporadic CJD(sCJD) 발생
: 광우병 소의 변성 prion의 식이에 의한 섭취 → variant CJD(vCJD) 발생
Aβ를 쥐의 두피절개 후 뇌실에 주입
: 주위 세포에 확산되어 Aβ aggregates를 형성함
: 이상과 같이 전파 능력을 가진 단백질을 propaganon으로 표현함
: Aβ 외의 propaganon으로는 tau와 α-synuclein(파킨슨 병)이 있음

AD에서의 tau의 독성

tau
: 세포골격(cytoskeleton)을 이루는 microtubule에 연관된(associated) 단백질
: microtubule의 표면에 결합하여 이의 형성과 안정화에 중요한 역할을 함
수용성 Aβ dimers
: 불수용성인 Aβ aggregates(plaques)로부터 서서히 유리됨
Aβ(42) dimers (사후 AD 뇌 피질로부터 정제된 것)
→ 정상 쥐 → 해마 부위에서의 신경돌기(neurite) 감소 → 병변
Aβ(42) dimers
: tau의 고 인산화(hyperphosphorylation)를 유도함
고 인산화된 tau(hyperphosphorylated tau)
: microtubule 표면에 결합할 수 없음
→ 신경세포 내에서 이들 단백질 간의 중합으로 신경섬유 엉킴(neurofibrillary tangles)을 형성함
→ tau 결합이 없는 microtubule은 붕괴됨
→ synapse에서 신경돌기(neurite) 위축
: 세포막 지질, 유동성, 그래서 pole에 해당하는 microtubule이 필요함; 신경돌기 끝에서 필요한 물질들이 세포 몸통(cell body)로 부터 확산되는 것은 어려운 일, 이러한 물질들과 결합한 kinesin과 dynein은 microtubule에 결합한 후 ATP를 소비하면서 이동하여 필요한 물질들을 운송함; microtubule의 손상, 물질이 동이 불가능함 → 신경돌기 위축
→ neurite 밀도의 감소(synaptogenesis 억제)
→ 장기 기억전환(long-term potentiation)억제와 장기 억제증(long term depression)유발

AD 발생에 대한 유전적 위험요소(NMDA receptor(NMDAR)risk factor), Ⅱ

NMDAR은 인지기능 유지에 중요한 역할을 함
AD환자의 전형적인 증상: 인지 기능 훼손 → 치매
NMDAR 기능장애 → 극복 → AD질환 치료 방법 ?
세포 밖 Mg++과 Zn++ 이 receptor의 이온 통로 부근 특정위치에 결합되어 있음
양이온 출입을 통제함
학습에 의한 glutamate의 NMDAR과의 결합 → 위 두가지 양이온이 유리됨
→ 양이온 출입이 허용됨
세포 밖 높은 농도의 Ca++ 과 Na+은 세포 내로
세포 내 높은 농도의 K+은 세포 밖으로
Transmembrane potential 감소(depolarization)
신경세포 내의 Ca++농도 증가
: 여러 가지 대사에 관여하는 효소들의 활성화 → 그 중 한가지로 tubulin 생합성 증가(microtubule의 기본 단위 물질, alpha와 beta form)
: tubulin 중합으로 microtubule이 생성 → 신경돌기(neurite) 생성
: 신경연접(synapse)에서 neurite 밀도 증가
→ 장기기억 전환(long-term potentiation)
과량의 glutamate에 의한 NMDAR 의 과활성화
: 세포독성이 나타남 → 이를 glutamate excitotoxicity(흥분독성)이라고 함(neuronal cell culture에서 나타남, in vivo? ) → neurite 감소 → 인지 기능 훼손(사후부검에서 NMDAR의 밀도는 연령 대조군에 비해 거의 변화가 없었음, excitotoxicity가 없었음을 의미)
: extrasynaptic NMDAR → 신경독성(가설)

γ-Aminobutyric acid(GABA) receptor(GABAR)

GABA는 interneuron과 해마에서 분비 됨
GABAR에 GABA의 결합
: Cl- 통로 개방 → Cl- 이온은 세포 내로 유입, K+ 이온은 세포밖으로 유출
Transmembrane potential 증가(hyperpolarization)
→ Ca++ 이온의 유입이 억제됨
→ 신경세포 내의 대사가 전반적으로 하향조절됨
→ glutamate excitotoxicity 억제
인지 기능: NADAR과 GABAR이 함께 활성화(transmembrane potential 유지)
사후 부검
: GAD(glutamate decarboxylase) 염색 → 정상(presynaptic neuron)
: GABAR(post synaptic neuron), 연령대조군에 비해 현저하게 감소함
→ 일부 학자: AD 환자에서 GABA ↑ / 일부 학자: AD 환자에서 GABA ↓
: Aβ → IFN-γ 분비 → GABAR의 붕괴(대조군 쥐에 GABA antagonist bicuculine 투여 → reduced paired pulse depression, enhanced responses to noxious mechanical stimulation, increased spontaneous activity); IFN-γ를 미리 투여한 시험군 쥐에 bicuculine 투여 → enhanced paired pulse depression, reduction in the response to noxious stimulation → GABAR disrupted)

AD 환자의 GABA 치료

뇌척수액에서 GABA농도가 낮다는 것이 확인된 6명의 환자에게 GABA분비를 촉진하는 물질인 THIP(4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo(5,4-c)pyridine-3-ol)를 환자가 받아들일 수 있는 최대용량으로 투여 → 인지 기능의 변화가 없었음 → GABA계의 부족이 치매발생과 무관 → NMDA receptor의 과활성화가 인지기능 저하의 직접적인 원인이 아님을 의미

neuroinflammation

Mixed culture of rat neuronal and astrocytic cells(Garwood et al. 2011)
: the presence of a small numbers of astrocytes: ↑Aβ-induced neuronal cell death
: Aβ → release of inflammatory cytokines from astrocytes →↑tau phosphorylation in neuronal cells
: anti-inflammatory agent, minocycline →↓neuronal cell loss
: putative tau kinases: cyclin-dependent kinase-5, glycogen synthase kinase-3β, p38/MAPK, JNK-1, and ERK
VEGF suppressed by IFNs( VEGF enhanced in inflammatory diseases other than neuroinflammatory diseases)
: Aβ → IFN-γ expression → inducing of VEGF-A mRNA expression and GAIT(IFN-γ-activated inhibitor of translation complex) expression → delayed binding of GAIT to mRNA → suppressing of VEGF-A translation (translational silencing) → resulting in VEGF-A suppression
: IFN-α2a → suppressing of VEGF expression through inhibition of PI3K and MAPkinase signaling pathways
Microglia
Mi-Hyang Cho et al. Autophagy. 2014 ; Christina Ising 등, Nature 표지, 2019년 11월
: 신경세포밖의 Aβ → microglia의 scavenger receptor를 통해서 세포 내로 이동(internalization) → autophagy에 의해서 분해됨
: activation of NLRP3 by Aβ → IL-1β 분비 → IL-1β receptor of neuronal cell → tau phosphorylation↑

Nature. 2019 Nov;575(7784):669-673
NLRP3 inflammasome activation drives tau pathology.

Reversible modulation of synaptic plasticity by VEGF

Conditional transgenic mice(VEGF overexpression or VEGF suppression in the hippocampus of adult mice)
VEGF overexpression
: angiogenesis, neurogenesis and memory ↑
VEGF suppression
: impaired memory without reducing hippocampal perfusion or neurogenesis
VEGF induction → long-term potentiation(LTP) ↑
Persisting VEGF level is required to maintain synaptic plasticity

정상상태에서의 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 제거AD 환자의 GABA 치료

염증 반응

IL-1β, IL-6, TNF-α 등의 PIC는 선천성 면역세포(macrophage, granulocyte 등) 표면에 결합된 NADPH oxidase(평소에는 불활성 상태)활성화 하여 과량의 superoxide 생산을 유도함
PIC는 평소에는 없던 효소 iNOS(inducible NO synthase)발현을 유도하여 NO gas 발생을 높임
NO + O2- → ONOOO-(peroxynitrite)
peroxynitrite → OH∙ radical 발생 → DNA 변형 유도
→ NO 결합을 통해서 직접 DNA 변형 유도
→ 단백질의 –SH 기에 결합(nitrosation)하여 단백질 기능을 억제
→ 단백질의 tyrosine residue에 결합하여 nitro-tyrosine 형성
→ 기능 억제
→ 세균을 포함한 여러 가지 세포의 세포 자멸 유도

AD 환자에서의 ROS 발생

뇌는 산소를 가장 많이 소비하는 기관
→ metabolic ROS가 다른 기관보다 많이 발생함
PIC에 의한 ROS의 발생
Aβ에 의한 NADPH oxidase의 활성화 → ROS 발생
Aβ는 neuronal cell의 NMDA receptor 또는 RAGE 등을 통해 neuronal cell에 이입함 → outer-mitochondrial membrane의 receptor를 통해서 mitochondria 내로 진입 → mitochondrial dysfunction → NADH 생산 감소 → 활성산소 소거 능력 저하 → 활성산소 피해 증가
Peroxynitrite에 의한 mitochondria superoxide dismutase 억제 → ROS↑
Peroxynitrite 에 의한 mitochondria electron transport chain 의 억제 → ATP 생산 감소 → 활성산소 피해 증가 → 각종 염증성 질환 중에서 혈중 peroxynitrite 검출은 강력한 염증성 질환임을 의미 → AD 환자 치료에는 강력한 염증 억제물질이 필요함