(주)엠진바이오 공정개발
연구 내용 및 성과

고순도 CK 생산 공정

1. 연구의 목표

1-1) 인삼의 유효성분인 CK(ginsenoside compound k) 생산의 목적

유효 성분의 생체 내 흡수율이 100%인 CK기능 물질의 제조

인삼(人蔘)의 학명은 “Panax ginseng C.A.Meyer” 로서 두릅나무과(Anliaceae) 인삼속(Panax) 식품에 속하며 다년생 반음지성 숙근초로서 2000년 이상 이용하여 온 진귀한 약재로 광범위하게 사용되어 왔다. 서양은 18세기에 알려지면서 생약치료제의 하나로 알려졌다. 가장 오래된 [神農本草經]에 약리의 내용이 기록되어 현대에 이르도록 수많은 효능이 밝혀지고 있다.

대부분 인삼사포닌은 구조적으로 triterpenoid dammarane 골격에 glucose, arabinose, xylose, rhamnose 등 당이 결합되어 생성된 배당체로서 인삼의 가장 중요한 약리활성 성분으로 인정되고 있고, 항암, 간기능보호, 항당뇨, 항산화, 면역기능증강, 혈관확장, 항피로와 항스트레스 등의 효능을 나타낸다고 한다. 배당체 화합물들은 함량과 분포상에서 가장 많은 천연물이고, 식물유래 의약품 중 terpenoid 다음으로 많이 사용되는 천연물질이다. 인삼 사포닌은 자연계에 존재하는 배당체 화합물과 마찬가지로 major 사포닌의 당 가수분해에 의하여 만들어진 minor 사포닌이major 사포닌에 비하여 흡수나 약효 등 면에서 휠씬 뛰어난 효과를 나타낸다고 한다. 인삼사포닌은 인삼의 가장 대표적인 약리 활성성분으로 화학공학기술의 발전에 따라 인공적인 합성을 위한 연구가 무수히 수행되었으나 성공하지 못하고 있는 실정이다. Minor 인삼사포닌은 주로 화학적, 물리학적, 미생물학적이나 효소학적 방법으로 기존에 대량 존재하는major 인삼사포닌의 변형을 통하여 사용되고 있으나 근래에는 주요 기능적 식품원료로서 미생물학적 공법의 발달로 발효를 통하여 대량생산의 기술이 발전되었으며 정제가공의 공법 또한 꾸준히 연구되고 있다.

인삼사포닌은 ginsenoside라고 불리우며, triterpenoid인 oleanane계 사포닌과dammarane type 사포닌으로 분류되며, dammarane type 사포닌은 구조특징에 근거하여 다시 protopanaxadiol계 사포닌(PPD)과 protopanaxatriol계 사포닌(PPT)으로 분류된다. protopanaxadiol계 사포닌은 C-3, C12, C-20에 수산기가 결합되어 있는 것으로 ginsenoside Rb1 , Rb2 , Rc, Rd, Rg3 , F2 , Rh2 , 및compound K(C-K), protopanaxadiol 등이 포함되고, protopanaxadiol계 사포닌은 C-3, C-6, C-12, C-20에 수산기가 결합되어 있는 것으로 ginsenoside Re, Rg1 , Rg2 , Rf, Rh1 , F1 , protopanaxadiol등 사포닌이 포함되며, ginsenoside Rb1 , Rb2 , Rc, Rd, Re, Rg1 등의 6종 사포닌이 백삼과 홍삼중에 전체 인삼 사포닌의90% 이상을 차지하고 있다.

이러한 구조상의 문제를 연구하며 밝혀지는 공통된 연구 결과에 의하면 Ginsenosides는 장내 미생물에 의해 대사되어 Compound K(C-K)로 전환되는 대사계를 규명하고 있으며 영양적 기능효과를 체내 흡수율의 중요성에 관심을 기울이게 되어 체외에서 발효기법을 도입, 발효에 의해 흡수가 용이한 비극성 대사체의 형태로 전환된 ginsenosides CK가 약효발현의 개인차이를 줄이고 효능의 극대화를 이룰 수 있다는 가설이 현실화 되었다.

1-2) 순도 CK 30%에서 고순도 50% 생산의 공정개발 목적

현재까지 인삼, 홍삼의 기능은 식품으로서의 영양평가에 맞추었으나, Ginsenoside의 각 지표성분이 밝혀짐에 따라 그 기능적 효과에 관심이 집중되어 임상적으로 기능과 안전성, 독성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
㈜ 엠진바이오는 생체내에서 흡수가 전량 이루어지는 ginsenoside-compound K에 중요성을 갖고 이에 대한 기능성 연구에 주력하며 세포기반의 연구(In vitro)를 선행하였으며 임상적 기능도 확인한 바 있다. 그러나 현재까지의 순도는 30% 수준으로서 약리적 효용성을 극대화시키기엔 역부족이라 판단하고 고순도 CK를 생산할 수 있는 공정개발이 시급함을 알게 되었다. 30%의 순도가 함유된 CK는 기능적 효용성을 방해하는 물질도 포함되어 있으므로 최대한 순도를 50% 이상으로 향상시킬 경우 목표가 지표에 특이적 소견을 분명히 하게 되므로 기능면에서 확실한 효과를 기대하게 된다. 또한 생산 단가를 낮출 수 있는 경제적 효과도 창출 할 수 있으므로 고순도 50% 생산공정은 반드시 필요하다.

1-3) 대량 생산 정제공정 확립 목적

대량생산의 공정확립으로 산업화를 안정화시키며 고순도의 대량정제 공법 수립으로 생산 단가 및 소비 단가를 낮추는 경제성의 창출 필요.

Bio-conversion기술을 이용한 인삼사포닌의 장점은 인삼, 홍삼 성분의 고분자 및 배당체 형태를 저분자화 하고 비배당체로 전환시켜 흡수율을 높이고, 독성은 낮추며, 생리 활성을 높임으로 인체 내에서 활용되어, 체력증진, 원기회복, 자양강장, 혈행개선 등에 도움을 줄 수 있다. 특히, 인체에 무해한 균주를 이용하여 과학적인 방법으로, 기존의 재래식 증숙 방법과는 달리 사포닌의 성분 전환을 표준화 하였다. 특히 재래식 증숙 방법에서는 전환되지 않는 Compound K, Rh1, Rh2등의 minor 인삼 사포닌성분은 최근 국제적인 논문에서도 그 유용성이 높은 것으로 많이 알려져 있으며, Bio-conversion을 이용한 방법에서는 그러한 유용성이 높은minor 인삼 사포닌이 많이 생성되는 것을 알 수 있다. ㈜엠진바이오는 현재 순도 30%인 CK를 정제(tablet)로 제조하여 CK-30이라는 품명으로 시판 중이다.
CK-30은 검사품목 245개에서 잔류 농약이 모두 불검출로 확인이 되어 독성과 안전성은 확인이 되었으나 생리활성물의 기능적 효용성은 고순도에서 더욱 효과적이다. 따라서 고순도 정제공정으로 대량 생산이 가능 할 경우 Polyacetylene 과 같은 ATP 생성 억제물질이 CK의 기능성을 방해함을 차단하고, 잔류농약 제거는 물론 그 효능은 극대화되며 그로인한 생산 단가와 소비자 단가도 절약 또는 하향할 수 있게 된다. 그러나 정제의 과정에서 식약처는 물과 주정을 사용할 것을 규격화 하였기에 고순도 정제는 어려운 과정이 많다. 하지만, ㈜엠진바이오는 CK를 크로마토그라피 기술을 적용하지 않는 대량 정제기술로써 순도 30%인 CK를 생산하고 있으며, ㈜엠진바이오는 CK를 크로마토그라피 기술을 적용하지 않는 대량 정제기술로써 순도 30%인 CK를 생산하고 있으며 50% 고순도 정제의 공정을 수립하였다. 의약품의 원료인 초고순도 95%이상의 원료제조공정도 이미 완료하였으며 이에 대한 것은 별도로 한다.

2. 개발내용

2-1) 원료로부터 유효물질 추출

건조된 4년근 인삼을 잘게 분쇄하여 환류 장치가 된 추출용기(Mantle)에서 70% 주정(8~12배)으로 24시간씩 2회 추출하여 추출물을 회전 증발 진공 농축 장치에서 50~60 brix로 농축한다.
농축물에 포함된 ginsenoside의 총량을 HPLC로 분석하여 발효준비를 한다.

2-2) 추출물의 발효

인삼사포닌의 당부분에는 주로glucose, arabinose, xylose, rhamnose 등의 당이ether 결합을 하고 있고 당과 aglycone의 결합에는 glc(1-3)C, glc(1-6)C, glc(1-20)C 결합이 포함되고 당과 당사이의 결합에는 glc(2-1)glc, glc(6-1)glc, glc(6-1)ara, glc(6-1)rha, alc glc(6-1)xyl 등 결합이 포함되어 있으며, 측쇄 부분에는 이중결합이 포함되어 있다. 인삼 사포닌의 구조에 있어서 고리부분은 상대적으로 화학적 성질이 안정한데 비해, 당부분과 측쇄 부분은 모두 화학반응이 잘 일어나는 부위로 minor 인삼사포닌 생산에서 특히 측쇄 부분에 의한 부반응 감소가 중요하다. β-glucosidase는 당을 가수분해하는 효소로 주로 두가지 가수분해 기작, 즉 구조반전(inversion)과 구조유지(retention)의 방식에 따라 반응을 촉매 한다. β-glucosidase의 촉매활성부위는 두 개의 카르복실기로서 두 작용기 사이의 거리가 약 10Å일때에는 inversion 기작의 형식으로 가수분해가 일어나고 거리가 약 5.5Å 일 때에는 retention 기작의 형식으로 가수분해를 진행한다. 효소에 의한 당의 가수분해에서 구조유지와 구조반전은 염기 가수분해와 마찬가지고 모두 당부분에서 일어나고 비당체 부분은 원래의 구조를 유지한다. 효소에 의한 인삼사포닌의 전환은 직접 미생물을 사용하거나 또는 미생물로 부터 분리한 효소를 이용하며 미생물은 주로 곰팡이나 세균 등을 이용하는데 ㈜ 엠진바이오에서는 Aspergillus niger 곰팡이 균주로부터 분리한 효소를 이용하고 있다. 따라서 ginsenoside 분해를 위한 특이 미생물군의 효소산물을 Ginsenoside 총량의 비례에 맞추어 혼합하고 추출물의 발효를 50°C 이상 온도에서150~200rpm으로 72시간 동안 진행한다.

3) 발효물의 농축과 정제

발효가 끝나면 90 °C 에서 10분간 열탕 처리를 하여 효소를 불활화 시키고 회전 증발 진공 농축 장치에서 발효물을 50~60 brix로 농축한다. 이어서 발효 농축물의 CK 함량을 분석하는 한편 정제를 위한 준비를 한다.

농축액은 물과 주정의 순차적용 분획물로 분리 정제의 단계를 거치며 감압 농축 시켜 냉동 건조를 진행하며 분말로 건조한다.

4) 고순도 CK 생산을 위한 연구

⦁ 발효 전후의 인삼 조성변화에 대해서는 다양한고찰이 필요하다. 발효를 통하여Bio-conversion으로 영향을 받는 부분은ginsenosides 만이 아니므로 발효조건에 따라 산성 다당체, 지용성성분, 질소화합물 등의 유효성분들이 가감되거나 변화되는 부분들도 있게 된다. 따라서 인삼 약효를 최대화할 수 있는 효율적인 발효기법과 정제에 의하여 순도를 높여야 할 필요가 있게 된다. ㈜ 엠진바이오는 축적된 기술을 바탕으로 고순도 CK 생산을 위하여 현재까지 순도 30% -CK 생산에서 50% 수준으로 높이기 위한 공정을 위해 1차와 2차에 거쳐 대량으로 CK를 생산하였다. 이것을 재발효에 다시 사용함으로써 CK의 전환량을 높였으며 농축물을 개별 분획물로 나누어 특화된 정제의 기술을 응용하였다. 추가 진행된 발효물은 회전 증발 진공 농축 장치에서 60brix로 농축하였고 물과 주정의 비례적용 (5:1 ~ 1:5) 등의 과정으로 정제 공정을 수차례 진행하였다. 마지막에 모든 분획물을 모아 순도 50%까지의 정제를 마친 분획물의 집합을 냉동 건조하여 분말로 제조하였다.

정제공정에 의하여 분말화를 마치고 HPLC에서 순도를 분석 확인하여 생산된 CK의 증가된 순도를 확인하였다.

그림7. 고순도로 생산된 CK분석

3. 공정개발의 연구 성과(결론)

㈜ 엠진바이오는 Ginsendside-compound K의 고순도 증진을 위하여 1차 및 2차의 대량 생산을 진행하였으며, 생산된 원료는 재공정에 투입
하는 방법으로 추출과 발효를 재진행 하며 고순도 CK-50% 정제 생산공정 개발을 완료하였다.
생물전환반응(bioconversion)이란 생체의 기능 또는 생체가 가지고 있는 생촉매의 기능을 이용하여 새로운 신생물 제품을 생산하고 이를 활용하여 의약품, 의약품 원료물질, 비타민, 유용 아미노산, 인지질, 식품원료 등을 포함한 다양한 제품을 생산해 낼 수 있는 생물산업의 꽃이라 할 수 있다.
이제, 인삼의 주요 성분으로 CK가 중요한 약리 활성성분으로 인정받고 있으며, 항암, 간기능보호, 항당뇨, 항산화, 면역기능증강, 혈관확장, 항피로와 항스트레스 및 인지기능 개선 등에서 효능의 결과를 수많은 보고서가 입증하고 있다.
그러나 이러한 약리효능의 극대화는 원료의 순도를 높일수록 더욱 분명해진다.
여기에 대한 논리는 ㈜ 엠진바이오가 기존의 저순도 CK와 고순도 50%의 차이를 동물실험에서 독성실험을 비교 분석하여 봄으로써 고순도 생산공정이 필요하다는 것을 확실히 보여주고 있다. (그림.8과 그림.9 -독성실험 비교분석-)